常见问答

 

l  实时荧光定量 Real-timePCR是如何进行定量检测?

实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)通过实时检测荧光信号强度的变化来监测PCR反应情况,解决了传统PCR难以对起始模板中的目的基因进行定量检测的难题。目的基因在起始模板中的含量越高,荧光信号强度达到可检出阈值的时间就越短,所经历的PCR循环数就越少。

l  实时荧光定量 PCR与常规PCR有何区别?

 

实时荧光定量 PCR

传统PCR

概述

实时检测PCR扩增反应

PCR循环结束后测定PCR产物的累积量

可否定量?

可以,定量数据来自于PCR的指数增长期,此时PCR产物的量与模板量成正比

不可以,尽管扩增条带的亮度可与已知浓度的条带进行比较,但只能获取半定量的结果

应用领域

基因表达定量

微阵列结果验证

质量控制与结果验证

病原菌检测

• SNP基因分型

拷贝数变异

• microRNA分析

病毒定量

• siRNA/RNAi实验

扩增基因用于:

测序

基因分型

克隆

总结

优势

提升检测的动态范围

无需Post-PCR处理

最低可检测至2倍差异

采集PCR指数期数据

荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比

不足

准确度差

灵敏度低

动态范围< 2 logs

分辨率低

不能自动化操作

结果不能以数量表示

溴化乙锭染色不能有效的定量

需要Post-PCR处理

l  Taqman探针是如何工作的?

Taqman探针法使用荧光探针检测PCR扩增过程中产生的特异PCR产物。具体过程是:

1.检测探针由包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸构建。当探针完整时,由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光(基于FRET原理)。

2.如果目标序列存在,结合到目标序列上的探针,将在引物延伸时被Taq DNA聚合酶(具有5’核酸外切酶活性)剪切。

3.探针被剪切后,报告基团与淬灭基团分离,报告基团的荧光信号增加。由于探针已从目标序列上去除,引物延伸将继续进行直至合成完整序列。

4.在每次PCR循环中,都有新的报告基团被剪切,因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。

Taqman探针法具有:1.特异性,荧光信号的产生,需要探针与目标序列进行特异性的杂交;2.探针可以标记不同的报告基团,因此可以在一个反应管中进行二条序列扩增;3.不需要后PCR处理,减少实验操作和样品消耗。由于探针与目标序列是特异性结合的,因此当进行不同序列的检测时,需要设计不同的特异性探针。